В центре трагедии — две основные сюжетные линии: судьбы Иоанна Грозного и Бориса Годунова. Первый предстаёт в трагедии уже на склоне лет, измождённым, и, сверх того, мучимым угрызениями совести из-за недавно совершённого преступления (в порыве гнева он насмерть зашиб посохом своего сына Ивана). В начале пьесы он собирается отречься от престола и уйти в монастырь, от чего его по совету Годунова отговаривает Дума.
Вернувшись на престол, Иоанн ненадолго оживляется: продолжает заниматься государственными делами, хочет развестись с царицей и жениться на племяннице английской королевы. Неудача, однако, продолжает преследовать его: в стране голод и разруха, русские войска терпят неудачу в войне с поляками, а с юга на Русь надвигаются татары. После того, как польский посол Гарабурда объявляет, что шведы взяли город Нарову и вместе с поляками отправились походом на Новгород, царь оказывается окончательно сломлен. В критический момент он понимает, что ему некого поставить на защиту государства, так как прежние его сторонники или казнены, или бежали от его гнева за границу. Видя на небе комету, Иоанн предрекает, что она принесла ему смерть, и действительно умирает вскоре после этого.
Борис Годунов в пьесе, напротив, возвышается — успешно борется с интригами, которые строят против него Бельские, Шуйские и Нагие, завоёвывает народную любовь и таким образом постепенно выходит из тени Иоанна. После смерти царя Годунов оказывается фактическим правителем, вершащим судьбы страны за спиной у его наследника Фёдора, и быстро расправляется со своими противниками (отправляет бояр в ссылку, Мстиславского — в монастырь, Нагих — в Углич вместе с царицею и Димитрием). Его судьба на этом не кончается, оставляя место для продолжения в последующих трагедиях трилогии.
